光动力学疗法治癌光敏剂的研究进展

　　作者：瞿燕、韩光范

　　光动力学疗法（photodynamic therapy, PDT）是近20年发展起来的一种新的治疗恶性肿瘤的方法。它与手术、化疗和放疗等三大传统的治疗肿瘤手段相比，具有许多优点和特点：对肿瘤有相对的选择特异性，能定向地消灭原发和复发肿瘤，很少损伤正常组织，毒副作用小；不影响其他治疗，可与化疗和放疗同时进行，且具一定的协同作用，可重复治疗；可借以缩小手术的范围和改善手术的预后；对各种癌症都有疗效，抗瘤谱较广等。自上世纪70年代进入临床研究以来，PDT在恶性肿瘤的治疗中取得了令人瞩目的成就，已成为肿瘤防治研究中的一个十分活跃的领域。很多国家都开展了肿瘤PDT的研究，并使成千上万的癌症患者受惠于这一疗法。它不仅能有效地治疗体表肿瘤，同样亦可治疗呼吸道、胃肠道、颅脑、眼、膀胱等部位的肿瘤。近年来美国、日本、荷兰和加拿大等国的卫生部门已相继确认了这一肿瘤新疗法的合法性。现在，PDT在治疗非肿瘤疾病方面也得到了广泛的重视，在不久的将来可能成为治疗皮肤病、老年失明、冠心病、艾滋病、自体免疫系统疾病和白血病等顽疾的有效手段。

　　在PDT治疗中，光敏剂或其代谢产物能选择性聚集于靶组织（肿瘤组织），在适当波长光的激发下产生光动力反应破坏靶细胞的化学物质。光敏剂分子接受光照，吸收光子的能量，在靶细胞内发生光化学反应，产生的活性氧（reactive oxygen species, ROS）具有细胞毒作用，能高效地氧化生物分子，最后诱导肿瘤细胞坏死。PDT对肿瘤的作用主要通过三方面的机制：（1）直接杀死肿瘤细胞；（2）破坏肿瘤组织内的血管，阻断肿瘤的氧和营养物质的供给；（3）免疫调节作用。研究发现，一些亲脂性的光敏剂易于附着在低密度脂蛋白上，而肿瘤细胞比静止细胞具有更多的低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor, LDLR）,所以此类光敏剂在肿瘤组织上聚集，从而直接杀伤肿瘤细胞。而亲水性的光敏剂则更多地通过白蛋白和血清蛋白的运输，聚集在肿瘤的间质和血管组织，破坏肿瘤的血管，切断肿瘤的氧和营养物质的供应，起到杀伤肿瘤的作用。

　　Cincotta认为光敏剂虽能歼灭大部分肿瘤细胞，但它不能百分之百地杀死肿瘤细胞，只有动员免疫功能发挥作用才能摧毁那些残留的癌细胞。在对Ergo科学公司研发的新品种苯吩噁嗪（benzophenoxazine）进行PDT实验时，观察到有新的蛋白质形成，并转移到细胞表面；PDT治疗后细胞毒性T细胞与肿瘤细胞反应。这种光敏剂对肿瘤细胞的杀伤不仅靠原子氧，还参与了免疫系统，发挥了免疫功能。

　　可见，在杀伤肿瘤细胞的过程中，光敏剂作为能量的载体和反应的桥梁起着决定性的作用。现就近年来光敏剂的研究进展作一综述。

　　一、 光敏剂的研究进展
　　 1．第一代光敏剂  最早用于PDT的光敏剂是血卟啉衍生物（hematoporphyrin derivative, HpD）。早在20世纪初，Hausmann 和Meyer-Betz发现了“血卟啉”的光毒效应。50年代，Schwartz发现引起光毒效应的不是血卟啉Hp本身，而是其中的血卟啉寡聚混合物杂质。为了提高血卟啉寡聚混合物的含量，Schwartz将血卟啉Hp与乙酸-硫酸反应后再与稀氢氧化钠水溶液反应而制HpD。该衍生物对肿瘤组织摄入的选择性明显优于血卟啉Hp。

　　80年代，在对HpD化学组成和对肿瘤光生物活性成分的分离鉴定后，Dougherty等从HpD中分离纯为目前临床上最常用的光敏剂，即光敏素2（Photofrin 2）。光敏素2于1992年由加拿大QLT光药物公司正式投产，是国际上第一个正式注册的光敏剂。光敏素2是由醚键、酯键和炭-炭键连接而成的混合卟啉制剂。其在波长630nm处有一个吸收峰，人体内半衰期在100h以上，从肿瘤内清除较正常组织为慢，最大的肿瘤/正常组织浓度比出现在给药后24~72h。光敏素2与HpD相比，肿瘤光生物活性较高，毒副作用更小。我国成功研制了癌光啉（HpD，北京）、癌光啉（PsD-007，上海）和光卟啉（HpD，扬州）3种混合卟啉制剂。由许德余等在80年代初独立研制成功的PsD-007是一种新型的混合卟啉制剂，肿瘤光生物活性成分是血卟啉单甲醚、甲氧基乙基乙烯基次卟啉和血卟啉二甲醚等3种卟啉，占到总量的80%以上。PsD-007的肿瘤光生物活性至少不低于光敏素2而明显高于HpD，对正常组织的光毒反应则远低于后两者。80年代扬州研制的光卟啉（HpD）是一种与光敏素2类似的混合卟啉制剂。北京HpD已获得国家新药试验批准文号，PsD-007于是1998年获准在军内临床试用。不过，不管是HpD、光敏素2，还是国产HpD（北京）、PsD-007都属于第一代光敏剂，虽然在临床上疗效肯定，但仍有不足之处：成分复杂，组成不定，排泄缓慢，需长时间避光防止皮肤光敏感作用。第一代光敏剂的作用光谱在对组织穿透好的红光区吸收低，其作用深度仅0.5cm，对PDT治疗大而深的肿瘤不理想。

　　2．第二代光敏剂  为了克服第一代光敏剂红光区吸收系数低，皮肤光敏反应等缺点，近10年来，人们一直致力于寻找更理想的光敏剂。第二代光敏剂大多是从血卟啉优化而来的，研究较多的是在600~700 nm的吸收系数较HpD高出约一个数量级的单体四吡咯化合物，许多是卟啉、二氢卟吩和细菌二氢卟吩的衍生物，其中，卟啉环共轭双键可还原成二氢和四氢，大环的还原导致低能量吸收带的红移。较典型的第二代光敏剂有叶绿素降解衍生物、金属酞菁、苯并卟啉以及二氢卟吩或中介取代芳基卟吩等。

　　（1）血卟啉单甲醚  血卟啉单甲醚（hematoporphyrin monomethyl ether, HMME）是我国首创的一种单体卟啉的新型光敏剂。HMME具有成分单一、结构稳定明确、光敏剂化力较强、肿瘤摄入率较高、对体内外癌细胞均具明显的杀伤作用、药物从组织中消除较快、毒副反应小等优点。用HMME治疗消化道恶性肿瘤取得了较好的疗效。另外，HMME-PDT对移植静脉内膜增生有抑制作用，可延缓静脉桥再狭窄的进程。HMME与国外同类产品相比价格低廉，有利于临床应用。

　　（2）氢化卟啉  近年来，氢化卟啉有可能成为PDT光敏剂而引起了人们的广泛兴趣。这是由于它们卟啉分子中双键的释放使得在红光区吸收系数高，对肿瘤组织的亲和力较HpD高出一个数量级，适合于组织穿透深的光源。许多二氢卟吩和细菌二氢卟吩有可能成为第二代PDT光敏剂的候选物。二氢卟吩m-THPC和细菌二氢卟吩m-THPC-BC在PDT治疗中能增强光敏活性。m-THPC被用于恶性间皮瘤和复发乳癌的PDT治疗，对肿瘤治疗具有高度选择性，并且在导致肿瘤广泛坏死时对正常组织损伤小。虽然如此，二氢卟吩和细菌二氢卟吩容易氧化回卟啉分子，为了避免这种情况的发生，在双键释放的吡咯环边上连大分子或连上一个外环，由此得到的化合物如锡-初紫红素（SnET）和苯并二氢卟吩（benzochlorin）是相当有效的。SnET已进入1/2期临床试验。研究表明，它不同于苯并卟啉衍生物或二氢卟吩e6单-L-天冬氨酰衍生物，无需在血浆药物浓度高时才被激活，因此就不会引起全身性的皮肤光敏反应，这或许可以提高疗效。

　　（3）酞菁和萘酞菁 酞菁（phthalocyanine）和萘酞菁（naphthalocyanine）的理化性质稳定，对长波长有强吸收，在红光区吸收系数较HpD高出10~50倍。因此进行PDT治疗时，只需要0.2~0.5mg/kg的小剂量,而光敏素2却需要1~5mg/kg的剂量。酞菁和萘酞菁能被制得纯品和具有不同的水溶性，其吸收性质优于卟啉类，而它们对于波长400~600nm的光没有强吸收,故皮肤光敏反应要比卟啉小得多。酞菁在体内的动力学作用比HpD快得多，经注射后1~3h内在肿瘤组织中达到最大值，并在24h内从体内清除干净，因此皮肤光敏反应只是短暂的。20世纪80年代以来，已先后报道了一系列有关酞菁对体外培养人癌细胞光灭活作用和动物移植瘤光动力损伤作用的实验结果，其中锌酞菁已进入1期临床试验。由于酞菁的高度憎水性，所以极性基团的引入可以解决溶解性问题。因此，可合成了不同磺化程度的酞菁化合物。但研究发现，铝酞菁[phthalocyaninato-Al (3), AlPc]在磺化程度直接影响了体外的光敏效应，其中二磺酸铝酞菁被认为是最有效的，且被看为是PDT候选药物。Al（Ⅲ）和其他抗磁阳离子，Zn（2）和Cu （2）提高了酞菁的三线态和单红态氧产率。所以，Al-PcS和ZnPc能有效地产生单线态氧，而CuPc却为零。ZnPc的三线态Φt和单线态氧产率Φ△分别为0.67与0.53,且皮肤光敏反应甚微。虽然很长一段时间人们都对极度憎水性的萘酞菁作为PDT光敏剂并不感兴趣，但SiNc和ZnNc做成脂质体却在体内显示出了活性。SiNc经注射给予荷MS-2纤维肉瘤的小鼠后，发现其在肿瘤中有明显的聚集，光辐照后能有效地杀死肿瘤细胞。萘酞菁对长波有很强的吸收，利用这一优点，可使PDT治疗深处肿瘤。

　　（4）叶绿素降解衍生物  叶绿素降解衍生物包括脱镁叶绿酸a(pheophorbide a)、二氢卟吩e6(chlorin e6)、紫红素-18(purpurin-18)、二氢卟吩e4(chlorin e4)和二氢卟吩P6(chlorin P6)以及它们各自的衍生物。有报道表明，其中二氢卟吩e6、紫红素-18和二氢卟吩P6及其衍生物具有比较理想的肿瘤光动力疗效。二氢卟吩e6具有两亲性能（亲水性和亲脂性），产生良好的肿瘤/正常组织比率，且吸收波长移到了红光区（664nm），单线态氧产率Φ△较高，对肿瘤的抑制率远好于HpD对肿瘤的抑制率。目前，国外报道较多的二氢卟吩e6衍生物二氢卟吩e6单天冬氨酸酰胺衍生物（mono-L-aspartyl chlorin e6,NPe6）已进入2期临床试验。在664nm波吸收系数是光敏素2的10倍，应用后2～4h在肿瘤内的聚集达到高峰，过敏反应弱，水溶性好，可从尿中排出。对NPe6的体内研究表明，它对小鼠移植性乳癌具有高效的光动力作用。药物动力学性质提示，主要的血管成分参与了NPe6的肿瘤杀伤作用。NPe6-PDT治疗肺部浅表鳞状细胞癌的1和2期临床试验中发现，NPe6对肿瘤的完全反应率分别达到87.5%和84.6%，均未发现副作用。许德余等由家蚕粪降解分离得二氢卟吩e6，并以此为原料合成的一系列二氢卟吩e6醚类、酰胺类及酯类衍生物。实验结果表明，此类化合物都具有较强的光敏化力和肿瘤光生物活性，尤其是化学性质稳定、合成步骤简单、肿瘤/正常组织分布比高、光敏化力和肿瘤光生物活性强的二氢卟吩e6单甲酯（chlorin e6-C monomethyl ester, CMME）,在给药后不同时间的肿瘤/皮肤分布比可高达2～9，而同样条件下HpD的肿瘤/皮肤分布比则不超过1.3；对小鼠S-180肉瘤的50%抑制剂量比HpD约高5~6倍，值得进一步研究。紫红素-18具有理想的可见光695 nm吸收波长，治疗深处肿瘤组织更具有优势，而且已经证明其具有高的单线态氧的产率，在迅速发展的PDT治癌药物的研究中一直作为二氢卟吩类药物的首选合成前体。紫红素-18酰亚胺衍生物在体内稳定。Rungta等合成并证明紫红素-18-N-N、N-二甲基乙基酰亚胺体外可与DNA相结合，鼓舞了人们发展此类化合物。另外，3-（1-己氧基）乙基紫红素-18-N-己基酰亚胺甲酯对试验动物有光动力学疗效，当给予小鼠1.0μmol/kg，用135J/cm2705 nm的光照射时，此光敏剂对移植性皮下RIF肿瘤细胞具有良好的光动力学疗效，显示很好肿瘤吸收性。二氢卟吩P6及其衍生物实验结果表明，它们在非细胞体系内的光敏化力和对动物移植瘤的光动力学疗效约高于HpD5 ~6倍。二氢卟吩P6三甲酯具有很好的溶解度和单线态氧产率，在非极性溶剂中的最大吸收波长达到674 nm。从这几点上考虑，二氢卟吩P6三甲酯比二氢卟吩e6作为PDT光敏剂更具有优异性。

　　（5）苯并卟啉衍生物  苯并卟啉衍生物（benzoporphyrin derivative,BpD）是一类具有明确化学结构的光敏剂。由原卟啉Pp的乙烯基经Diels-Alder加成而得到的第一个二氢卟吩类光敏剂，可以合成其高纯度的成品。它既有与HpD中各成分相似的卟啉母核，又有与二氢卟吩类似的红光区高吸收系数，因而光敏反应的规模可以放大，被认为是PDT治癌较为理想的光敏剂。其中苯并卟啉衍生物单酸环A（benzoporphyrin derivative monoacid ring A,BpD-MA）是最近10年来新光敏剂中最具有代表性且已广泛深入研究的一种卟啉类衍生物。BpD-MA的最大的吸收峰在690 nm，可用组织穿透深的光激发，且具有相当高的三线态氧（ΦT=0.68）和单线态氧(Φ△=0.78)产率。BpD-MA对肿瘤细胞及异常增生细胞有很强的光敏杀伤作用，BpD-MA用于PDT治疗皮肤癌、牛皮癣及风湿性疾病已进入1/2期临床试验阶段。Lui等用它对22例皮肤癌患者进行PDT治疗，给予BpD-MA0.2~0.5mg/kg,以能量密度为50~150 J/cm2的690 nm光照射64个病灶,完全反应和部分反应率为74%,且可以快速地从体内清除,降低了皮肤光敏反应(3 ~5d)，而不像光敏素2需要4 ~6周。注射BpD-MA后3h或不到3h就产生最大的光动力效果。Richter等研究发现，T淋巴细胞摄入BpD-MA的量是脾正常淋巴细胞的5~10倍。当足够的光照射血液中的BpD-MA时，可使含有BpD-MA的细胞产生毒性反应，而对血管和皮肤不产生光毒效应。因此可以通过透皮光辐照而达到激活循环系统中该光敏剂，假如此时第一相血浆清除完全，且在皮肤中没有药物蓄积，则进行光照就不会引起皮肤光敏反应。由于BpD-MA具有这种优点，使整个给药和治疗过程可在当天完成，便于临床应用。

　　（6）其他  值得一提的是中国科学院化学研究所研制的光敏剂竹红菌素，包括竹红菌素A（hypocrellin A,HA）和竹红菌素B（hypocrellin B，HB），是从竹红菌素中提取出来的稠环醌类化合物。多年以来，科研人员对竹红菌素进行了大量的卓有成效的研究。目前，竹红菌素已经在临床上被应用于多种皮肤病的PDT治疗。带有特定结构修饰的竹红菌素在PDT治疗肿瘤的抗病毒方面表现出优越的性能。

　　5-氨基酮戊酸（5-aminolevulinic acid,ALA）是一种内源性光动力治疗药物，本身无光动力效应，在体内经一系列酶的作用生物合成具有光敏作用的原卟啉PP （PPIX）后才发挥作用的。其作用光谱与HpD类似，在波长630 nm处有一个吸收峰，滞留期为24 h。ALA-PDT几乎无副作用，研究表明ALA进入人体后1 ~3 h，组织中PPIX的含量达到高峰，6 h后逐渐下降，24 h后组织中测不到PPIX。ALA结构简单，易于合成，临床可用于治疗膀胱癌、牛皮癣、日光性角化病等疾病，通过酯化、酰胺化，可克服其生物利用度低的缺陷，具有较好应用前景。美国Dusa Pharmaceutical公司用其进行2期临床实验，治疗颜面部及头皮的癌前病变光化性角化病，得到阳性结果。

　　二、最新研究进展
　　最近，PDT光敏剂的研究出现了一些新的进展，尤其是在设计合成具有靶向给药功能更强的光敏剂以及光敏剂介导抗癌药物等方面取得了令人振奋的发现。

　　1、具有靶向给药功能更强的光敏剂  作为光敏剂，在肿瘤组织中的选择性聚集是至关重要的。最近，针对第二代光敏剂的缺点，在第二代光敏剂的基础上交联上某些特殊的化学物质，为第二代光敏剂的衍生物，进一步提高了靶组织的选择性。这些化学物质简单的如多聚体（polymers）和脂质体（liposomes）,复杂的如靶组织表达的抗原或受体的相应抗体和配体等。如氨基酸偶联光敏剂、聚合物偶联光敏剂、蛋白质或糖偶联光敏剂等。Jain等用化合物1为原料合成了化合物2，然后通过亲核取代将短肽链CGKWK接在卟啉分子外侧，合成了化合物3。Walker等先从SV40毒T-细胞核中合成得来线性肽链G-G-V-K-R-K-K-K-P-G-Y-G，然后将肽链连接到紫红素-18分子外侧，得到了化合物。

　　在研究发现，一些特定序列的肽链对肿瘤细胞外围血管具有识别功能，当它作为侧基引入治疗药物分子后，可引导化疗药物的靶向给药。这一结果无疑对含肽链光敏剂的设计与合成具有重要的指导意义。

　　肿瘤相关抗原现已被证明是细胞膜的糖蛋白或糖脂，肿瘤细胞的去接触抑制、浸润和转移，都可能是癌细胞表面糖链结构和构造的细微变化所致。实验表明，糖基能与DNA链选择性结合，利用糖基引导药物分子进攻靶细胞具有较高的准确性，可以增强光敏剂在肿瘤组织中的聚集。Zheng等利用烯炔的作用机制合成了糖基紫红素-18酰亚胺，并发现糖基的接入使得整个分子的水溶性有很大提高，可以更有效地到达肿瘤组织。

　　此外，将光敏剂与寡核苷酸共价偶联后，寡核苷酸对靶序列的选择性和专一性结合将赋予光敏剂以基因靶向特异性，而光敏剂对寡核苷酸进行的化学修饰也可改善或克服寡核苷酸本身存在的缺陷，且在适当波长的光激活下可达到基因封闭和光动力杀伤恶性肿瘤的目的，即双重杀伤作用。

　　2．介导抗癌药物光敏剂  光敏剂本身就具有在病变组织上选择性聚集的功能，所以它发挥光动力疗效的同时，对抗癌药物进行靶向性介导，从而使抗癌药物有效地到达肿瘤组织。这样做的目的是希望从根本上改变现有抗癌药物虽有一定疗效，但大多具有不良反应严重、靶向性差、需配合手术治疗的状况。延玺等选取具有多种生物效应并对癌细胞有一定亲和作用卟啉类物质m-THPP作为导向剂，甲氨蝶呤作为抗癌有效成分，将两者进行化学偶联，组成新的化合物。结果表明，给予甲氨蝶呤治疗的小鼠中，80%的小鼠死亡，抑瘤率为79.35%；而在同样剂量下，用卟啉做先导物的治疗组，只有30%小鼠的死亡，但抑瘤率仍保持在75.82%。相比之下，经过介导的甲氨蝶呤引发动物的死亡率降低了许多。这是一个可喜的发现提示我们，现有抗癌药物经过用光敏剂进行结构改造或介导作用，有可能使它们的药效提高或者副作用降低，可起到事半功倍的效果。